Glutathione Beads(GST填料)

Catalog NO.：BE6948
Applications ：
Reactivity ：

货号	规格	品牌	库存	价格	数量	操作
BE6948-5ml	5ml
BE6948-25ml	25ml
BE6948-100ml	100ml

产品详情
参考文献

1. 产品介绍

Glutathione Beads 可以一步纯化各种表达系统表达的谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽转移酶的重组衍生物。 Glutathione Beads 是以 4%琼脂糖凝胶为基质，通过 12 个原子的间隔臂，用化学方法共价结合了还原型谷胱甘肽制作而成。这种特别设计使填料的纯化效率得到了提高，因此填料载量大于 20 mg GST 融合蛋白。Glutathione Beads 具有载量高、特异性好、性价比高的特点。

表 1. Glutathione Beads 产品性能

项目	性能
基质	4%琼脂糖凝胶
配体	通过 12 原子间隔臂偶联的谷胱甘肽
载量	>20 mg GST 蛋白(40 kDa)/ml 基质
微球粒径	45– 165 μm
最大压⼒	0. 1 MPa ， 1 bar
pH 稳定范围	3- 12
储存缓冲液	含 20% 乙醇的 1XPBS
储存温度	2-8C

2. 纯化流程

2.1 缓冲液的准备

缓冲液在使用前最好用 0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤。

平衡/洗杂液：140 mM NaCl ，2.7 mM KCl ，10 mM Na2 HPO4 ，1.8 mM KH2 PO4 ，pH 7.4

洗脱液：用平衡液配制 10 mM 还原型谷胱甘肽 (现配现用)

注意：平衡液和洗脱液中可加入 1– 10 mM DTT。

2.2 样品准备

样品在上样前建议离心或用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2.1 细菌或酵⺟表达的蛋⽩

1) 挑取单菌落到培养基中，根据载体使用说明，加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2) 表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7,000 rpm(7,500×g) ，离心 15 min 收集菌体，然后按照菌体：平衡液=1：10 (W/V) 加入平衡液，加入终浓度为 1 mM 的 PMSF。加入溶菌酶 (工作浓度为 0.2-0.4 mg/ml ，如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE ，可以不加溶菌酶) ， (同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与填料的结合) 。

3) 将菌体沉淀悬浮起来， (如果菌液浓度高，也可考虑加入 10 μg/ml RNaseA 和 5 μg/ml DNase I) ，混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4) 将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000 rpm(15,000×g) ，4C离心 20-30 min。取上清，置于冰上备用或-20C保存。

2.2.2 酵⺟、昆⾍和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋⽩

1) 将细胞培养液转移至离心杯，5,000 rpm(3,800×g) ，离心 10 min ，收集菌体得上清，即可直接加入柱子使用。

2) 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，蛋白还需用平衡液透析后才能加入柱子。

2.3 Glutathione Beads 重⼒柱的装填

1) 取合适规格的重⼒层析柱，装入下垫⽚，加入适量纯水润洗柱管和垫⽚，关闭下出⼝。

2) 将 Glutathione Beads 混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重⼒柱中 (介质实际体积占悬液的一半) ，打开下出⼝流⼲保护液。

3) 加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重⼒流⼲后，关闭下出⼝。

4) 装入润洗后的上垫⽚，确保垫⽚与填料之前没有空隙，且保持水平。

5) 装填好的重⼒柱可以直接加入平衡液进⾏平衡，暂不使用时则加入保护液，2-8C保存。

2.4 样品纯化

2.4.1 孵育法纯化

1) 根据纯化的样品量，取适量 Glutathione Beads 加入离心管中，1000 rpm 离心 1 min ，吸弃上清；也可加入重⼒柱中，流⼲保护液。

2) 向离心管中加入 5 倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm 离心 1 min ，吸弃上清；如使用重⼒柱，则直接在重⼒柱中清洗，直接重⼒流⼲平衡液；重复两次以上。

3) 加入样品，封闭离心管或重⼒柱管，4C振荡孵育 2-4 h 或者 37C孵育 30 min-2 h。

4) 孵育结束后，1000 rpm 离心 1 min ，吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。

5) 用 5 倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm 离心 1 min 或重⼒柱管过滤，去除上清 (注意不要吸到介质) ，重复 3-5 次，中间建议更换新离心管。

6) 加入 3-5 倍柱体积的洗脱液进⾏洗脱，室温孵育 5min ，1000 rpm 离心 1 min 或重⼒柱管收集洗脱液，可重复 2-3 次。

2.4.2 重⼒柱法纯化

1) 将装填好的 Glutathione Beads 重⼒柱用 5 倍柱体积平衡液进⾏平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复 2-3 次。

2) 将样品加到平衡好的重⼒柱中，样品保留时间至少 2 min ，保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3) 用 10-15 倍柱体积的洗杂液进⾏洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4) 使用 5-10 倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。

上述步骤洗脱结束后，用平衡液冲洗 3 倍柱体积，然后用纯水冲洗 5 倍柱体积，再用保冲洗 2 个柱体积，然后将介质置于 2-8℃保存。

2.5 SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品 (包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分) 以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。

3. 填料清洗

GST 标签蛋白纯化产品可以重复使用而⽆需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量性能下降，这时需要对填料进⾏清洗。

去除一些沉淀或变性物质，建议使用下面的方法

用 2 倍柱体积的 6 M 盐酸胍溶液进⾏清洗，然后立即用5 倍柱体积的 PBS ，pH 7.4 清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗，然后立即用 5 倍柱体积的 PBS ，pH 7.4 清洗。

4. 问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	填料被堵塞	按照第3部分进⾏填料清洗。
	填料被堵塞	裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜 (0.22μm或0.45μm) 过滤，或者离心去除。
	样品太粘稠	样品中含有高浓度的核酸，加⻓破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I (终浓度 5 μg/ml) ，Mg2+ (终浓度 1 mM) ，冰上孵育10- 15分钟。
	缓冲液太粘稠	有机溶剂或者蛋白稳定试剂 (如甘油等) 可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白	GST标签蛋白变性了	使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。
	过度的裂解使目的蛋白变性	使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。
	目的蛋白聚集产生了沉淀	在细胞裂解前溶液中加入DTT ，终浓度为1–20 mM。
	融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合⼒	测定pGEX 中GST的结合⼒，对载体进⾏超声处理，检测其结合⼒。如果载体中GST 有很高的亲和⼒，有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和⼒。
	融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合⼒	降低结合温度至+4°C ，充分地清洗。
洗脱组分中没有目的蛋白	柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在 pH6 .5-pH8范围内结合的	用 pH 6.5 – pH 8.0的Buffer进⾏充分的平衡 (例如PBS) 。
柱子反压过高	填料被堵塞	按照第3部分进⾏填料清洗。
	填料被堵塞	裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜 (0.22μm或0.45μm) 过滤，或者离心去除。
	样品太粘稠	样品中含有高浓度的核酸，加⻓破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I (终浓度 5 μg/ml) ，Mg2+ (终浓度 1 mM) ，冰上孵育10- 15分钟。
	缓冲液太粘稠	有机溶剂或者蛋白稳定试剂 (如甘油等) 可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白	GST标签蛋白变性了	使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。
	过度的裂解使目的蛋白变性	使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。
	目的蛋白聚集产生了沉淀	在细胞裂解前溶液中加入DTT ，终浓度为1–20 mM。
	融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合⼒	测定pGEX 中GST的结合⼒，对载体进⾏超声处理，检测其结合⼒。如果载体中GST 有很高的亲和⼒，有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和⼒。
	融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合⼒	降低结合温度至+4°C ，充分地清洗。
	柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在 pH6 .5-pH8范围内结合的	用 pH 6.5 – pH 8.0的Buffer进⾏充分的平衡 (例如PBS) 。
目的蛋白没有完全洗脱下来	洗脱体积太少	增加洗脱液体积，减小洗脱流速。
	洗脱液中谷胱甘肽浓度太低	增加洗脱液中谷胱甘肽浓度，可尝试用50 mM Tris-HCl, 20–40 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0洗脱。
	低pH影响洗脱	在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时，提高洗脱液中pH至pH 8–9 会有改善。
	低pH影响洗脱	增加洗脱液中离子强度，如0. 1–0.2 M NaCl。
	洗脱液中的谷胱甘肽被氧化	使用新鲜配制的洗脱液。
	洗脱液中的谷胱甘肽被氧化	加入 DTT。
	非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解与洗脱	洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0. 1%的Triton X- 100 或者2%正辛基- β-D- 吡喃葡糖苷Tween-20。
电泳或western blot检测中发现多条带	Mr 70 000 蛋白与目的蛋白一起被纯化出来	Mr 70 000的蛋白有可能是大肠杆菌基因dnaK 的产物，可以通过在目的蛋白中加入 50 mM Tris-HCl, 2 mM ATP, 10 mM MgSO4 , pH 7.4在37°C加热10 分钟去除。
	Mr 70 000 蛋白与目的蛋白一起被纯化出来	可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的DnaK 蛋白。
	GST融合蛋白已经发生降解	在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF。
	GST融合蛋白已经发生降解	有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon- 或ompT)。
	细胞破碎过度	减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶(菌液体积的0. 1倍的 10 mg/ml溶菌酶，25 mM Tris-HCl, pH 8.0) ，避免发泡导致蛋白变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST 融合目的蛋白的共纯化。
	共价共纯化	包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK (Mr ~ 70 000) ， DnaJ (Mr ~ 37 000) ， GrpE (Mr ~ 40 000) ，GroEL (Mr ~ 57 000) 和 GroES (Mr ~ 10 000)。可再进⾏一次纯化可以改善。
	抗体与E. coli 的各种蛋白反应	抗体吸附E. coli蛋白：GST-抗体。超声处理去除GST抗体，可以用Western Blots 检测。

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