标签蛋白抗体
主要包括:常规标签抗体、直标标签抗体

Glutathione Beads(GST填料)

Catalog NO.:BE6948
Applications :
Reactivity :

货号 规格 品牌 库存 价格 数量 操作
BE6948-5ml 5ml
BE6948-25ml 25ml
BE6948-100ml 100ml

 

1.  产品介绍

Glutathione Beads 可以一步纯化各种表达系统表达的谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽转移酶的重组衍生物。           Glutathione Beads 是以 4%琼脂糖凝胶为基质 ,通过 12 个原子的间隔臂,用化学方法共价结合了还原型谷胱甘肽制作而成。这种特别设 计使填料的纯化效率得到了提高,因此填料载量大于 20 mg GST 融合蛋白。Glutathione Beads 具有载量高、特异性好、性价比高的特点。

表 1. Glutathione Beads 产品性能

项目

性能

基质

4%琼脂糖凝胶

配体

通过 12 原子间隔臂偶联的谷胱甘肽

载量

>20 mg GST 蛋白(40 kDa)/ml 基质

微球粒径

45– 165 μm

最大压⼒

0. 1 MPa ,  1 bar

pH 稳定范围

3- 12

储存缓冲液

含 20% 乙醇的 1XPBS

储存温度

2-8C

2.  纯化流程

2.1 缓冲液的准备

缓冲液在使用前最好用 0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤。

平衡/洗杂液:140 mM NaCl ,2.7 mM KCl ,10 mM Na2 HPO4 ,1.8 mM KH2 PO4 ,pH 7.4

洗脱液:用平衡液配制 10 mM 还原型谷胱甘肽  (现配现用)

注意:平衡液和洗脱液中可加入 1– 10 mM DTT。

2.2 样品准备

样品在上样前建议离心或用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤 ,减少杂质 ,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2.1 细菌或酵⺟表达的蛋⽩

1) 挑取单菌落到培养基中 ,根据载体使用说明 ,加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2) 表达结束后 ,将培养液转移到离心杯中 ,7,000 rpm(7,500×g) ,离心 15 min 收集菌体 ,然后按照菌体:平衡液=1:10  (W/V)  加入平 衡液 ,加入终浓度为 1 mM 的 PMSF。加入溶菌酶  (工作浓度为 0.2-0.4 mg/ml ,如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE ,可以不加溶 菌酶)  ,    (同时也可加入其他蛋白酶抑制剂 ,但不能影响目的蛋白与填料的结合)  。

3) 将菌体沉淀悬浮起来 ,    (如果菌液浓度高 ,也可考虑加入 10 μg/ml RNaseA 和 5 μg/ml DNase I)  ,混匀 ,放置于冰上 ,然后冰上超声 破碎细胞 ,至菌液基本保持澄清。

4) 将澄清的破碎液转移至离心管中 ,10,000 rpm(15,000×g) ,4C离心 20-30 min。取上清 ,置于冰上备用或-20C保存。

2.2.2 酵⺟、  昆⾍和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋⽩

1) 将细胞培养液转移至离心杯 ,5,000 rpm(3,800×g) ,离心 10 min ,收集菌体得上清 ,即可直接加入柱子使用。

2) 对于大量体积的上清 ,需加入硫酸铵沉淀浓缩后 ,蛋白还需用平衡液透析后才能加入柱子。

2.3 Glutathione Beads 重⼒柱的装填

1)  取合适规格的重⼒层析柱 ,装入下垫⽚ ,加入适量纯水润洗柱管和垫⽚ ,关闭下出⼝。

2)  将 Glutathione Beads 混合均匀 ,用枪头吸取适量浆液加入至重⼒柱中  (介质实际体积占悬液的一半)  ,打开下出⼝流⼲保护液。

3)  加入适量纯水冲洗介质 ,待柱管中液体重⼒流⼲后 ,关闭下出⼝。

4)  装入润洗后的上垫⽚ ,确保垫⽚与填料之前没有空隙 ,且保持水平。

5)  装填好的重⼒柱可以直接加入平衡液进⾏平衡 ,暂不使用时则加入保护液 ,2-8C保存。

2.4 样品纯化

 

 

 

2.4.1 孵育法纯化

1)  根据纯化的样品量 ,取适量 Glutathione Beads 加入离心管中 ,1000 rpm 离心 1 min ,吸弃上清;也可加入重⼒柱中 ,流⼲保护液。

2)  向离心管中加入 5 倍介质体积的平衡液清洗介质 ,1000 rpm 离心 1 min ,吸弃上清;如使用重⼒柱 ,则直接在重⼒柱中清洗 ,直接重 ⼒流⼲平衡液;重复两次以上。

3)  加入样品 ,封闭离心管或重⼒柱管 ,4C振荡孵育 2-4 h 或者 37C孵育 30 min-2 h。

4)  孵育结束后 ,1000 rpm 离心 1 min ,吸弃上清 ,或过滤收集介质 ,上清保留作为流穿 ,用于电泳鉴定。

5)  用 5 倍介质体积的洗杂液清洗介质 ,1000 rpm 离心 1 min 或重⼒柱管过滤 ,去除上清  (注意不要吸到介质)  ,重复 3-5 次 ,中间建议 更换新离心管。

6)  加入 3-5 倍柱体积的洗脱液进⾏洗脱 ,室温孵育 5min ,1000 rpm 离心 1 min 或重⼒柱管收集洗脱液 ,可重复 2-3 次。

2.4.2 重⼒柱法纯化

1)  将装填好的 Glutathione Beads 重⼒柱用 5 倍柱体积平衡液进⾏平衡 ,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下 ,重复 2-3 次。

2)  将样品加到平衡好的重⼒柱中 ,样品保留时间至少 2 min ,保证样品和介质充分接触 ,收集流出液 ,可以反复上样增加结合效率。

3)  用 10-15 倍柱体积的洗杂液进⾏洗杂 ,去除非特异性吸附的杂蛋白 ,收集洗杂液。

4)  使用 5-10 倍柱体积的洗脱液洗脱 ,分段收集 ,每一个柱体积收集一管 ,分别检测 ,既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱 ,又可以得 到高纯度和高浓度的蛋白。

 

上述步骤洗脱结束后 ,用平衡液冲洗 3 倍柱体积 ,然后用纯水冲洗 5 倍柱体积 ,再用保冲洗 2 个柱体积 ,然后将介质置于 2-8℃保存。

2.5 SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品  (包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)  以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。

 

3.  填料清洗

GST 标签蛋白纯化产品可以重复使用而⽆需再生 ,但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集 ,往往造成流速和结合载量性能下降, 这时需要对填料进⾏清洗。

去除一些沉淀或变性物质 ,建议使用下面的方法

用 2 倍柱体积的 6 M 盐酸胍溶液进⾏清洗 ,然后立即用5 倍柱体积的 PBS ,pH 7.4 清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗 ,然后立即用 5 倍柱体积的 PBS ,pH 7.4 清洗。

 

4.  问题及解决方案

 

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

按照第3部分进⾏填料清洗。

裂解液中含有微小的固体颗粒 ,建议上柱前使用滤膜  (0.22μm或0.45μm)  过滤 ,或 者离心去除。

样品太粘稠

样品中含有高浓度的核酸 ,加⻓破碎时间直至粘度降低 ,或者添加DNase I    (终浓度 5 μg/ml)   ,Mg2+    (终浓度  1 mM)   ,冰上孵育10- 15分钟。

缓冲液太粘稠

有机溶剂或者蛋白稳定试剂  (如甘油等)  可能会引起反压增高 ,降低操作流速。

洗脱组分中没有目的蛋白

GST标签蛋白变性了

使用温和的裂解条件 ,实验条件以经验为准。

过度的裂解使目的蛋白变性

目的蛋白聚集产生了沉淀

在细胞裂解前溶液中加入DTT ,终浓度为1–20 mM。

融合蛋白改变了GST的构象,影响了 目的蛋白的结合⼒

测定pGEX  中GST的结合⼒,对载体进⾏超声处理,检测其结合⼒ 。如果载体中GST 有很高的亲和⼒ ,有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和⼒。

降低结合温度至+4°C ,充分地清洗。

洗脱组分中没有目的蛋白

柱子平衡时间太短 ,目的蛋白不是在 pH6 .5-pH8范围内结合的

用  pH 6.5 – pH 8.0的Buffer进⾏充分的平衡  (例如PBS)  。

柱子反压过高

填料被堵塞

按照第3部分进⾏填料清洗。

裂解液中含有微小的固体颗粒 ,建议上柱前使用滤膜  (0.22μm或0.45μm)  过滤 ,或 者离心去除。

样品太粘稠

样品中含有高浓度的核酸 ,加⻓破碎时间直至粘度降低 ,或者添加DNase I    (终浓度 5 μg/ml)   ,Mg2+    (终浓度  1 mM)   ,冰上孵育10- 15分钟。

缓冲液太粘稠

有机溶剂或者蛋白稳定试剂  (如甘油等)  可能会引起反压增高 ,降低操作流速。

洗脱组分中没有目的蛋白

GST标签蛋白变性了

使用温和的裂解条件 ,实验条件以经验为准。

过度的裂解使目的蛋白变性

目的蛋白聚集产生了沉淀

在细胞裂解前溶液中加入DTT ,终浓度为1–20 mM。

融合蛋白改变了GST的构象,影响了 目的蛋白的结合⼒

测定pGEX  中GST的结合⼒,对载体进⾏超声处理,检测其结合⼒ 。如果载体中GST 有很高的亲和⼒ ,有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和⼒。

降低结合温度至+4°C ,充分地清洗。

柱子平衡时间太短 ,目的蛋白不是在 pH6 .5-pH8范围内结合的

用  pH 6.5 – pH 8.0的Buffer进⾏充分的平衡  (例如PBS)  。

目的蛋白没有完全洗脱下 来

洗脱体积太少

增加洗脱液体积 ,减小洗脱流速。

洗脱液中谷胱甘肽浓度太低

增加洗脱液中谷胱甘肽浓度 ,可尝试用50 mM Tris-HCl, 20–40 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0洗脱。

低pH影响洗脱

在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时 ,提高洗脱液中pH至pH 8–9  会有改善。

增加洗脱液中离子强度 ,如0. 1–0.2 M NaCl。

洗脱液中的谷胱甘肽被氧化

使用新鲜配制的洗脱液。

加入  DTT。

非特异性疏水作用影响目的蛋白的 溶解与洗脱

洗脱液中加入非离子型洗涤剂,如0. 1%的Triton X- 100  或者2%正辛基- β-D- 吡喃葡糖 苷Tween-20。

电泳或western blot检测中 发现多条带

Mr 70 000  蛋白与目的蛋白一起被 纯化出来

Mr 70 000的蛋白有可能是大肠杆菌基因dnaK  的产物 ,可以通过在目的蛋白中加入 50 mM Tris-HCl, 2 mM ATP, 10 mM MgSO4 , pH 7.4在37°C加热10  分钟去除。

可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的DnaK  蛋白。

GST融合蛋白已经发生降解

在裂解液中加入蛋白酶抑制剂 ,如加入1 mM PMSF。

有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的 ,可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon- 或ompT)。

细胞破碎过度

减少细胞破碎时间,超声前加入溶菌酶(菌液体积的0. 1倍的  10 mg/ml溶菌酶,25 mM Tris-HCl, pH 8.0) ,避免发泡导致蛋白变性 ,过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST 融合目的蛋白的共纯化。

共价共纯化

包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化 ,如 :DnaK (Mr ~ 70 000) ,    DnaJ (Mr ~ 37 000) ,    GrpE (Mr ~ 40 000) ,GroEL (Mr ~ 57 000)  和  GroES (Mr ~ 10 000)。可 再进⾏一次纯化可以改善。

抗体与E. coli  的各种蛋白反应

抗体吸附E. coli蛋白:GST-抗体。   超声处理去除GST抗体,可以用Western Blots  检 测。

 

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