标签蛋白抗体
主要包括:常规标签抗体、直标标签抗体

Dextrin Beads 6FF

Catalog NO.:BE3752
Applications :
Reactivity :

货号 规格 品牌 库存 价格 数量 操作
BE3752-1ml 1ml
BE3752-5ml 5ml
BE3752-25ml 25ml

1 .

Dextrin Beads 6FF是一种纯化带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签蛋白的亲和层析介质,具体性能见表1。MBP可促进连接蛋白的正确折  叠,增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。Dextrin Beads 6FF可以一步纯化MBP融合蛋白,结合的融合蛋白可

以用10mM麦芽糖进行温和洗脱,保护了标签蛋白的活性。如果要去除MBP融合部分可用位点特异性蛋白酶切除。

 

表1.Dextrin Beads 6FF产品性能

性能

指标

基质

配体

载量

粒径范围

最大压力

pH稳定范围

储存缓冲液

储存温度

高度交联的6%琼脂糖微球

糊精

>10 mg MBP蛋白(80 kDa)/ml介质

45-165 μm

0.3 MPa,3 bar

3-12

含20%乙醇的1XPBS

2-8℃

 

 

2 .

2.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液:20 mM Tris-HCl,200 mM NaCl,1mM EDTA,pH7.4

洗脱液:20mM Tris-HCl,1mM EDTA,10mM麦芽糖,pH7.4

注意:平衡液和洗脱液中可加入1mM DTT或10mMβ-巯基乙醇

2.2 样品准备

样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.3 Dextrin Beads 6FF装填

2.3.1重力柱的装填

1)取合适规格的重力层析柱,装入下垫片,加入适量纯水润洗柱管和垫片,关闭下出口。

2)Dextrin Beads 6FF混合均匀,用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占悬液的一半),打开下出口流干保护液。

3)加入适量纯水冲洗介质,待柱管中液体重力流干后,关闭下出口。

4)装入润洗后的上垫片,确保垫片与填料之前没有空隙,且保持水平。

5)装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡,暂不使用时则加入保护液,2-8℃保存。

2.3.2 中压层析柱的装填

Dextrin Beads 6FF被广泛应用于工业纯化,因此,涉及到各种中压色谱层析柱的填装,下面介绍填装层析柱的方法。

装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积,根据所需装柱高度计算所需介质体积,公式如下:

V =1.15m²h

V:所需介质体积ml

1.15:压缩系数

r:柱管半径cm

h · 装填高度cm

 

 

 

 

注意: 所取悬液体积应为介质体积的两倍,因为介质体积只占悬液总体积的一半,另一半为保护液。

1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2 cm 的去离子水。 2)将介质悬浮起来,小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3)如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。 4)打开层析柱底部出口,开启泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液 压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速,可以用你所使用泵的最大流速,这样也可以得到  一个很好的装填效果。(注意:在随后的色谱程序中,不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后,在最后的装柱流速下至少再上3

倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5)关闭泵,关闭层析柱出口。

6)如果使用储液器,去除储液器,将分配器置于层析柱中。

7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。

8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2.4样品纯化

2.4.1 孵育法纯化

1)根据纯化的样品量,取适量Dextrin  Beads   6FF加入离心管中,1000 rpm 离 心 1min,   吸弃上清;也可加入重力柱中,流干保护液。 2)向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质,1000 rpm 离 心 1min, 吸弃上清;如使用重力柱,则直接在重力柱中清洗,直接重 力流干平衡液;重复两次以上。

3)加入样品,封闭离心管或重力柱管,4℃振荡孵育2-4 h 或者37℃孵育30 min-2 h。

4)孵育结束后,1000 rpm 离 心 1min, 吸弃上清,或过滤收集介质,上清保留作为流穿,用于电泳鉴定。

5)用5倍介质体积的洗杂液清洗介质,1000 rpm 离 心 1min 或重力柱管过滤,去除上清(注意不要吸到介质),重复3-5次,中间建议更 换新离心管。

6)加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱,室温孵育5min,1000   rpm离 心 1min 或重力柱管收集洗脱液,可重复2-3次。

2.4.2重力柱法纯化

1)将装填好的Dextrin  Beads  6FF 重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下,重复2-3次。 2)将样品加到平衡好的重力柱中,样品保留时间至少2min, 保证样品和介质充分接触,收集流出液,可以反复上样增加结合效率。  3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。

4)使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱,分段收集,每一个柱体积收集一管,分别检测,既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱,又可以得 到高纯度和高浓度的蛋白。

2.4.3中压层析柱法纯化

Dextrin  Beads  6FF 装填好后,可以用各种常规的中低压色谱系统。

1)将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子,将层析柱连接至色谱系统中,打开下出口,将预装柱接到色谱系统中,并旋紧。 2)用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。

3)使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。

4)利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少,也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大 量的样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。

5)用洗杂液冲洗柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。

6)使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱,收集洗脱液,即目的蛋白组分。

介质洗脱结束后,用平衡液冲洗5-10柱体积,然后用纯水冲洗5-10个柱体积,再用20%乙醇冲洗2个柱体积,置于2-8℃保存。

2.5  SDS-PAGE检测

将使用纯化产品得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用SDS-PAGE  检测纯化效果。

 

 

3. 填料清洗

Dextrin Beads 6FF 纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量都下 降,这时可按照下面方法对填料进行清洗。

1)3倍柱体积的去离子水;

2)3倍柱体积的0.1% SDS 或0.1 M  NaOH溶液;

3)3倍柱体积去离子水,20%乙醇2-8℃保存。

 

 

4.问题及解决方案

 

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

按照第3部分进行树脂清洗。

裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45 μm)过滤,或者 离心去除。

目的蛋白没有吸附

目的蛋白未表达

确保目的蛋白表达

样品或缓冲液中存在一些干扰因素如非

离子去污剂

样品透析或用平衡液稀释

细胞产生大量的淀粉酶影响结合力

培养基中添加葡萄糖,抑制淀粉酶的表达

融合蛋白使麦芽糖结合位点阻塞或扭 曲,影响了目的蛋白的结合力

更换载体

柱子结合时间太短

将样品与Dextrin Beads 6FF振荡孵育4℃ 2h或更长时间

洗脱样品较杂

目的蛋白降解

加一些蛋白酶抑制剂,如PMSF、EDTA等

平衡/洗杂不充分

增加平衡液体积,确保树脂充分平衡/洗杂,如树脂太脏按照第3部分进行树脂清洗。

 

 

5.订购信息及相关产品

 

名称

货号

规格

 

Dextrin Beads 6FF

 

BE3752-1ml

1ml

BE3752-5ml

5ml

BE3752-25ml

25ml

 

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