标签蛋白抗体
主要包括:常规标签抗体、直标标签抗体

rProtein A/G Beads 4FF

Catalog NO.:BE6868
Applications :
Reactivity :

货号 规格 品牌 库存 价格 数量 操作
BE6868-5ml 5ml
BE6868-1ml 1ml

1.产品简介 

rProtein A/G Beads 4FF 是将 rProtein A/G 高密度定向偶联到高度交联的琼脂糖凝胶微球表面,该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率,洗脱条件更均一,一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于 90%的抗体。产品性能见表1。

本产品主要用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究,也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的种属来源及亚型选择微球的类别,Protein A,Protein G 和 Protein A/G 与不同抗体的亲和性比较参见表2。

表 1. rProtein A/G Beads 4FF 产品性能

指标

性能

基质

高度交联的

配体

重组蛋白A/G

载量

10-15mg 人 lgG/ml 介质

粒径 (μm)

45-165

最大压力

0.3 MPa ,3 bar

pH 稳定范围

3-10

储存缓冲液

含20% 乙醇的 1XPBS

储存温度

 2°C -8°C

表 2. Protein A、Protein G 和 Protein A/G 对不同抗体的结合能力

种属

亚型

Protein A

Protein G

Protein A/G

Human

IgA

varible

++

IgD

IgE

IgG1

++++

++++

++++

IgG2

++++

++++

++++

IgG3

++++

++++

IgG4

++++

++++

++++

IgM

varible

++

Avian egg yolk

IgY

Cow

 

++

++++

++++

Dog

 

++++

++

++++

Goat

 

++++

++++

Horse

Total

IgG

++

++++

Monkey(rhesus)

 

++++

++++

++++

Mouse

IgG1

+

++++

++

 

IgG2a

++++

++++

++++

 

IgG2b

+++

+++

+++

 

IgG3

++

+++

+++

 

IgM

variable

Pig

 

+++

+++

++++

Rabbit

Total IgG

++++

+++

++++

Rat

IgG1

+

++

 

IgG2a

++++

++++

 

IgG2b

++

++

 

IgG3

+

++

++

++++=结合能力强; ++=结合能力中等; —=结合能力弱或没有结合

纯化流程

本产品主要应用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究。

2.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤。

平衡/ 洗杂液: 0.15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0

洗脱液: 0.1M 甘氨酸,pH 3.0

中和液:1M Tris-HCl,pH 8.5

交联液:0.2 M 三乙醇胺, pH 8.2

交联剂:DMP(dimetyl pimelimidate dihydrochloride)

终止液:50 mM Tris, pH 7.5

2.2 样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值,可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释,或者样品用平衡/洗杂液透析。对于100 mm 培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,使用预冷PBS洗涤一次后加入2ml细胞裂解液裂解细胞。对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。植物或动物组织样品可以使用液氮研磨方法裂解。具体的裂解方法请参考不同裂解液的使用说明,裂解液最终总蛋白浓度选择在 0.5-1μg/μl范围内较为合适。通常针对目标蛋白的表达量不同,需要对总蛋白浓度进行预实验调整。

2.3. 去除非特异性结合(可省略)

1) 取200微升至1毫升蛋白样品,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的Normal IgG和20微升充分重悬的rProtein A/G Beads 4FF,4℃缓慢摇动30分钟。

2) 2500rpm (约1000g)离心1分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。

注:哺乳动物细胞内有多种成分可以和IgG 发生结合,可能会在后续免疫印迹中出现非特异性条带。使用 normal IgG 和 rProtein A/G Beads 4FF 对裂解液预处理可以降低非特异性吸附。

2.4 免疫沉淀操作流程

免疫沉淀直接法操作流程示意图如下:

 

 

2.4.1 抗体吸附

1)取适量的 rProtein A/G Beads 4FF 加入到 2ml 离心管中,800rpm 离心 1min,吸弃 上清。

2) 加入 0.5ml 平衡液,悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋 白的作用),800rpm 离心 1min,吸弃上清。再重复两次。

3) 向步骤 2) 平衡的填料中加入抗体溶液,悬浮填料,室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管,约 30min 后,800rpm 离心 1min,收集上清液,留待检测。

4) 向 3) 的填料中加入 0.5ml 的洗杂液,悬浮填料,进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋 白,800rpm 离心 1min,吸弃上清。再重复两次。

2.4.2 抗体交联 (备选)

如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略本步骤,直接进行 2.4.3。50ul-1ml 填料量均可以按照以下步骤操作,无需额外增加交联液体积。

1) 向清洗过的填料中加入1ml 交联液,800rpm离心1min,吸弃上清。

2) 再向其中加入1ml 含20 mM DMP(dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联液,此试剂需要现用现配,悬浮填料,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管,促使缓冲液和填料充分接触, 约 30min 后,800rpm 离心1min,吸弃上清。

3) 再向其中加入1ml 终止液,悬浮填料,终止交联反应,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管, 约 15min 后,800rpm 离心 1min,再吸弃上清。

4) 加入0.5ml 的洗杂液,悬浮填料,进行清洗,800rpm 离心1min,吸弃上清。再重复两次。

2.4.3 抗原沉淀反应

1) 抗原吸附:加入含有抗原的样品,用移液器轻轻吹打使抗原与填料-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4℃下反应过夜。

2) 洗杂:将上述完成抗原吸附的填料-抗体-抗原复合物进行离心,800rpm 离心 1min,收 集上清液,置于冰上以备后续检测。向离心管中加入1ml洗杂液,用移液器轻轻吹打使填料-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行离心分离,800rpm 离心 1min,弃上清液。 再重复洗涤两次。最后加入 1ml 洗杂液,用移液器将填料-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 ml离心管中,并进行离心分离,800rpm 离心 1min,弃上清液。

3) 抗原洗脱:提供以下两种抗原洗脱方案,可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

变性洗脱法:此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测。向离心管中加入 25μl 1× SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀,95℃ 加热5min。然后进行离心,800rpm 离心 1min,收集上清液,进行 SDS-PAGE 电泳,转膜后进行Western分析。

非变性洗脱法:此方法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析。向离心管中加入5倍柱体积的洗脱液,用移液器吹打5次,混匀,然后在室温下置于翻转混合仪或者 手工轻轻翻转离心管,10min后,离心,800rpm 离心 1min,吸取上清液,收集洗脱组分,即为目标抗原,收集上清液至新的离心管中,并立即加入十分之一体积的中和液,将洗脱组分pH调节至7.0-8.0,用于后期功能分析。

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